吴茱萸化学成分分析论文

2022-05-08

本论文主题涵盖三篇精品范文,主要包括《吴茱萸化学成分分析论文(精选3篇)》,欢迎阅读,希望大家能够喜欢。摘要:药用植物是我国极其宝贵的自然资源之一,开展药用植物的研究具有重要的理论与现实意义。随着分子生物学的快速发展,DNA分子标记技术作为一种新的遗传标记技术越来越广泛地应用于药用植物研究的许多领域中。

吴茱萸化学成分分析论文 篇1:

基于胃寒证的吴茱萸水提物镇痛及伴随毒副作用机制

[摘要]对吴茱萸水提物在胃寒证小鼠模型上镇痛作用的药效剂量范围及机制进行初步研究。制备胃寒证小鼠模型,采用经典的小鼠热板法,灌胃不同剂量吴茱萸水提物,观察其镇痛及伴随毒副作用,检测血清ALT,AST,PGE2,NO,NOS,MDA,SOD,GSH,GSH-Px,BUN,CR及肝脏ALT,AST;并通过相关的毒性反应积分表,记录小鼠的伴随毒性症状。吴茱萸水提物在药后30 min有明显的镇痛作用,60 min达到峰效应,呈现一定的“量-效”和“时-效”关系,血中和肝内 ALT和AST水平升高,血中PGE2,MDA,NO,NOS水平的增高,SOD,GSH,GSH-Px水平下降,BUN,CR水平无明显变化,肝体比值增加,肾体比值无明显变化。吴茱萸水提物发挥镇痛效应的机制与抑制疼痛介质释放、过氧化损伤及NO损伤有关;在发挥镇痛效果的同时还会伴随着对肝脏产生一定的毒性,毒性机制主要为氧化损伤,呈现与肝毒性损伤相并行的“量-时-毒”关系。

[关键词]吴茱萸;水提物;小鼠;胃寒证;镇痛;毒副作用

Study on efficacy accompanied by side effects of water extraction

components of Evodiae Fructus based on syndrome model

LI Xiao-yu, SUN Rong*

(Shandong Academy of Chinese Medicine, Ji′nan 250014, China)

[Key words]Evodiae Fructus; water extraction components; mice; stomach cold syndrome; abirritation; toxicity and side effect

doi:10.4268/cjcmm20151414

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa (Juss) Benth.、石虎E. rutaecarpa (Juss) Benth var. officinalis (Dode) Huang. 或疏毛吴茱萸E. rutaecarpa (Juss) Benth.var. bodinier (Dode) Huang.的干燥近成熟果实。吴茱萸味辛、苦,性热,有小毒。归肝、脾、胃、肾经。能散寒止痛,降逆止呕,助阳止泻,为温中止痛的必备药。主要用于厥阴头痛、经行腹痛、呕吐吐酸、五更泄泻<sup>[1]</sup>。近年来,学者们对吴茱萸的化学成分、药理作用等方面进行了深入研究,发现吴茱萸主要含有生物碱、挥发油、苦味素等化学成分<sup>[2-3]</sup>,具有广泛的药理活性<sup>[4-6]</sup>,其中生物碱是吴茱萸的主要有效成分之一,而吴茱萸次碱是生物碱中最主要的活性成分<sup>[7-8]</sup>。然而,近年来,临床上曾有服用吴茱萸过量致死的报道<sup>[9]</sup>,吴茱萸水提物中所含的化学成分是吴茱萸的有效成分之一,同时也是毒性成分<sup>[10]</sup>。通过前期研究,已经证实了吴茱萸水提物药效与毒副作用的关联性,明确了吴茱萸水提物作用于正常小鼠的镇痛及伴随毒副作用<sup>[11-12]</sup>。鉴于传统中医药理论以辨证论治为治病原则,中药的毒性应当放在证候的背景下进行合理评价和科学认知,而吴茱萸又有散寒止痛、助阳止泻的功效,因此,本研究中制备了胃寒证小鼠模型,对吴茱萸水提物的镇痛作用和同剂量下可能产生的毒副作用进行了观察和评价,以期为临床安全合理用药提供依据。

1材料

1.1药品与试剂

吴茱萸(北京同仁堂饮片有限责任公司,批号20120914),经鉴定为芸香科植物吴茱萸E. rutaecarpa的干燥近成熟果实,按《中国药典》(2010年版)吴茱萸项下检查,符合各项规定。吴茱萸水提物(批号20121010),由本试验室提取制备:取吴茱萸药材1 500 g,分别加10,8,8倍量水加热回流提取3次,每次1 h,16层纱布滤过、合并滤液,浓缩,根据试验要求配置成所需浓度。双氯芬酸钠肠溶片(扶他林,批号120726),北京诺华制药有限公司生产,规格每片25 mg,人日用量100~150 mg。双姜胃痛丸(120815),西双版纳版纳药业有限公司,规格每袋3 g,人日用量4.5~9 g。ALT,AST,PGE2,NO,NOS,MDA,SOD,GSH,GSH-Px,BUN,CR测定试剂盒购自南京建成股份有限公司。

1.2仪器

PL303精密电子天平(瑞士梅特勒托利多仪器有限公司);可调式移液器(上海赛默飞世尔仪器有限公司);560 全自动生化分析仪(德国贝尔公司);DDL-5型低速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);DZKM-S-6电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂);UV-2600紫外-可见分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司];Multiskan Go-1510全波长酶标仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。

1.3动物

SPF级KM小鼠,雌性,体重18.0~22.0 g,适龄、健康。购自山东大学实验动物中心,动物合格证号SYXK(鲁)20130001。

2方法

2.1吴茱萸水提物及阳性药剂量设计

根据吴茱萸水提物的经口急性毒性试验结果和吴茱萸水提物多次给药致小鼠肝毒性“量-时-毒”关系研究为依据,设定吴茱萸水提物高、中、低剂量组分别为2.5,1.25,0.63 g·kg-1,均按25 mL·kg-1·d-1灌胃1次,按体表面积比值折算为等效剂量的2倍,即设定双姜胃痛丸的小鼠剂量为1.17 g·kg-1用蒸馏水将其溶解。正常组灌服蒸馏水,药物组各剂量组分别灌服一定剂量的药物。因本实验探讨中药药物作用,同时西药中并没有药物可以针对胃寒证,因而设置中药复方阳性药物组和西药阳性药物组进行论证。

2.2动物分组

取雌性小鼠140只,随机分为14组,每组10只,即对照组、双姜胃痛丸组、吴茱萸水提高、中、低剂量组,每一组根据时间点分为给药1 d和给药3 d剂量组。

2.3胃寒证小鼠模型的制备

上述小鼠稳定3 d后撤食不撤水12 h,所有小鼠分别同时放入29~31 ℃的水中(水深以小鼠无法跳出盒子为准),持续游泳5~6 min,体力消耗殆尽,然后将小鼠拿出,休息5 min后,重复2次。5 min后,除对照组外,所有药物组按25 mL·kg-1小鼠体重灌服0 ℃冰水,观察其证侯表现,24 h成模后给药,进行吴茱萸水提物功效及伴随毒副作用试验。

2.4镇痛实验及镇痛机制研究

根据文献进行小鼠热板筛选并记录药前痛阈值,根据体重和痛阈值随机分组,于实验前8 h禁食、不禁水,给药1 d剂量组均为先造模,后给药;给药3 d组均为第1天给药,第2造模,第3天给药。然后与相应时间点称小鼠体重,其中第1天雌鼠于药后90 min检测其热板痛阈值,第3天于药后30,60,90,120,180,240 min检测其热板痛阈值,热板检测完后,取部分小鼠,分别取血,3 000 r·min-1离心10 min,取血清,以生化分析仪测定PGE2,NO,MDA和SOD的含量和活性,考察其镇痛药效机制。

2.5药效伴随毒实验研究

给药后密切观察小鼠的生存状况,对于小鼠出现的毒性症状进行相关的毒性反应积分,记录小鼠的伴随毒性症状。热板检测完后,另取部分小鼠,分别取血,3 000 r·min-1离心10 min,取血清,以生化分析仪测定ALT,AST,NO,NOS,MDA,SOD,GSH,GSH-Px,BUN,CR。剖取部分小鼠肝脏称重并计算脏器指数。取一部分肝组织,留做肝内ALT,AST检测。

2.6统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件,数据用±s表示,计量资料先进行正态检验,正态分布资料采用单因素方差分析,非正态分布资料先转换成正态分布再用单因素方差分析。进行组间比较,P<0.05为数据统计有显著性差异。

3结果

3.1吴茱萸水提物对胃寒证小鼠镇痛实验及机制研究

3.1.1吴茱萸水提物对胃寒证小鼠热板法痛阈的影响吴茱萸水提物给药1 d对热板法致痛胃寒证小鼠有明显的镇痛作用,呈现一定的剂量依赖关系,与模型组比较,高、中、低剂量组分别呈现不同程度的显著性差异。吴茱萸水提物给药3 d,药后30 min对胃寒证小鼠即可显示明显的镇痛作用,水提组分低剂量组与模型组、对照组均呈非常显著性差异(P<0.005),其余各剂量组均呈极显著性差异(P<0.001),与双姜胃痛丸组比较镇痛效果相当;60 min达到峰效应一直持续到240 min未见明显降低,结果见表1,2。

3.1.2吴茱萸水提物对胃寒证小鼠镇痛机制研究吴茱萸水提物给药1 d可降低血PGE2水平,升高NO水平,与模型组比较,呈现不同程度的显著性差异,低剂量组与双姜胃痛丸组比较镇痛效果相当,提示吴茱萸水提物对胃寒证小鼠发挥镇痛效应的机制主要与降低血PGE2水平,抑制疼痛介质释放有关;另外也与过氧化损伤、NO损伤有关。结果见表3,4。

3.2药效伴随毒实验研究

3.2.1吴茱萸水提物对胃寒证小鼠药效伴随毒性症状吴茱萸水提物给药后没有出现腹泻,无明显的怠动,也未见其他明显的异常表现。

3.2.2吴茱萸水提物对胃寒证小鼠药效伴随毒实验体重变化的影响造模后小鼠体重出现一定程度的降低。给药后,吴茱萸水提物对小鼠体重影响不明显,与阳性药物组比较无统计学差异;药后3 d,小鼠体重慢慢恢复,与水对照组比较无统计学差异,结果见表5。

3.2.3小鼠药效伴随毒生化指标检测吴茱萸水提物高、中剂量和双姜胃痛丸,在给药1 d后与模型组比较,可导致胃寒证小鼠血中ALT和AST水平升高(P<0.05),第3天达到峰值,与模型组比较有不同程度的显著性差异,而扶他林与模型组比较无明显差异。吴茱萸水提物高剂量组在给药1 d后可导致血和肝中ALT,AST水平升高,ALT指标表现为灵敏,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05),而扶他林与对照组比较无明显差异。吴茱萸水提物在给药1,3 d后均没有导致血肾功指标的异常,与阳性药物组比较也无显著性差异,提示没有肾脏损伤,见表6~9。

3.2.4小鼠药效伴随毒重要脏器指数检测与模型组比较,吴茱萸水提物和阳性药物均可导致肝体比值增加,且随着剂量增大和给药时间延长,肝体比值逐渐增加。吴茱萸水提物各剂量和阳性药物均未出现肾体比值的增加,提示没有肾损伤,见表10。

3.2.5小鼠血清药效伴随毒机制指标检测吴茱萸水提物高剂量组在药后第1天,即出现NO,NOS水平的增高,其余各个剂量组与水对照组比较无显著性差异。在上述药效指标里MDA是最灵敏的机制指标,在药后3 d,水提组分高剂量组MDA水平,与对照组比较呈非常显著性差异(P<0.005);SOD,NOS,GSH,GSH-Px与对照组比较均呈显著性差异(P<0.05)。提示吴茱萸不同组分导致的肝毒性损伤所涉及到的毒性机制主要为氧化损伤,呈现与肝毒性损伤相并行的“量-时-毒”关系,见表11,12。

4讨论

古籍中早有对吴茱萸的毒性记载。《别录》言其“大热,有小毒”。《药性论》曰:“吴茱萸,味苦、辛,大热,有毒”。《本草纲目》载吴茱萸“多食伤神,令人起伏气,咽喉不通”,“不宜多用恐损元气”,“有小毒,动脾火,病目者忌之”等。《食疗本草》中记述吴茱萸“肥健人不宜食”。可见,古人对吴茱萸的毒副作用已有深刻的认识。早在北宋,《太平圣惠方·治水泻诸方》中就载有茱萸方,主治虚寒型下痢水泻,因而研究表明,茱萸方剂对胃黏膜均有一定的保护作用,但因为寒热属性不同,对不同胃黏膜损伤的保护具有选择性。且临床上因服用了未炮制完全的吴茱萸或生品吴茱萸,或因超剂量服用而产生中毒的报道时有发生,本实验室在前期的研究中,发现吴茱萸水提物给予较高剂量可对正常动物造成肝功指标异常和肝组织病理损伤。因而本实验选择建立胃寒证模型进行探讨,观察了吴茱萸水提物对胃寒证动物的镇痛作用及伴随的毒副作用,并进行相关机制的探讨。

本实验结果发现,吴茱萸水提物对在药后30 min对胃寒证小鼠有明显的镇痛作用,60 min达到峰效应,呈现一定的“量-效”和“时-效”关系,小鼠血中和肝内 ALT和AST水平均升高,且血中增高更明显,血中PGE2,MDA,NO,NOS水平的增高,SOD,GSH,GSH-Px水平下降,BUN,CR水平无明显变化,肝体比值增加,肾体比值无明显变化。提示吴茱萸水提物发挥镇痛效应的机制与抑制疼痛介质的释放、过氧化损伤及一氧化氮损伤有关;在发挥镇痛作用的同时吴茱萸水提物还会伴随着对胃寒证小鼠肝脏产生一定的毒性,毒性机制主要为氧化损伤,呈现与肝毒性损伤相并行的“量-时-毒”关系。与前期吴茱萸对正常动物的研究<sup>[12]</sup>比较,本实验中对胃寒证小鼠的肝毒性有一定的减轻。因此,临床应用时应该引起重视。关于其肝脏损伤的机制将进行进一步的研究。

目前我国对中药毒性的研究,基本沿用了现代毒理学中的研究思路与方法。而以中医理论为指导,对伴有证候、病证动物机体的研究仍然相当匮乏。如在中药新药研究过程中,会因为其偏性而在正常机体上反映出较大毒性而被淘汰。实际上,根据“有故无殒”的理论,因为没有病邪的存在,药性作用于机体,就表现出毒性,药性作用于病邪,表现出来的就是治疗作用。因此,当前中药安全性评价的思路与模式,既要积极借鉴西方现代毒理学最新研究成果,更要充分体现中药毒性理论的思想内涵。

[参考文献]

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[12]孙蓉,黄伟.吴茱萸水提组分镇痛及伴随毒副作用研究[J].中国药物警戒,2012,9(11):641.

[责任编辑张宁宁]

作者:李晓宇 孙蓉

吴茱萸化学成分分析论文 篇2:

DNA分子标记技术在药用植物上的应用

摘 要:药用植物是我国极其宝贵的自然资源之一,开展药用植物的研究具有重要的理论与现实意义。随着分子生物学的快速发展,DNA分子标记技术作为一种新的遗传标记技术越来越广泛地应用于药用植物研究的许多领域中。本文简要介绍了DNA分子标记在药用植物研究中一些常见技术(如RAPD、RFLP、AFLP、SCAR、ISSR、SNP等),同时对分子标记技术在药用植物种质资源鉴定、药用植物遗传多样性、药用植物亲缘关系鉴定等方面的应用进行了较详尽的阐述。最后,对DNA分子标记技术的应用前景进行了展望。

关键词:药用植物 分子标记 应用

Application of DNA Molecular Marker in Medicinal Plants

ZHOU Jie WANG Zhonghua

(1. Institute of Biotechnology, Zhejiang Wanli university, Ningbo,Zhejiang 315100; 2.College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou,Zhejiang 310018)

Key words:Medicinal plants;DNA molecular marker;application

“藥用植物的种质资源”,是泛指一切可用于药物开发的植物遗传资源,是所有药用植物物种的总和[1]。目前,人工种植的药用植物大部分来自野生种,因此其种质资源具有较多的遗传多样性,即使在同一种药用植物个体间也存在较大的差异。因此,与其他植物相比,进行药用植物种质资源的鉴定显得更为重要。传统的鉴定方法,是以药材表型特征为基础的鉴别方法,包括形态组织的比较和化学成分分析。基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定是传统鉴定中的四大经典方法[2]。但是,这些采用表型的鉴定方法,不仅受遗传因素的影响,环境条件及自身的生长发育阶段等也会影响其鉴定结果的准确性,极大地限制了这些方法的应用。近年来发展起来的DNA分子标记技术,可比较直接的反应出遗传特性,而且不受生长发育阶段、环境等条件的影响,在药用植物种质资源鉴定、遗传多样性、亲缘关系分析及育种应用等方面具有广泛的应用前景。本文对这些技术的基本原理及其在药用植物上的应用进行了简要的综述。

1 DNA分子标记技术

1.1 随机扩增多态性DNA(RAPD技术)

RAPD是1990年由Williams[3]和Welsh[4]领导的2个研究小组发展起来的,建立在PCR基础之上的一种DNA分子标记技术。它采用任意的非特异性单一引物,对研究对象基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物通过电泳、染色来显示扩增DNA片断的多态性。杨红花[5]等用RAPD技术对经组织培养后的红叶臭椿多态性进行了检测,以确定茎尖培养的组培苗后代是否具有较高的遗传稳定性。结果发现16条随机引物共扩增出98条特异性条带,其中32条具有多态性,占32.65%,由此表明组培苗后代遗传变异较小,遗传稳定性较高。

由于RAPD技术的重现性较差,对此国内外研究者普遍认为,RAPD标记完全适用于种内水平的亲缘关系的研究,也可用于种间乃至近缘属间亲缘关系的研究,但有较大的局限性[6]。

1.2 序列特异扩增区域(SCAR技术)

SCAR是于1993年由Paran和Michelmore在RAPD技术的基础上发展建立的一种可靠、稳定、可长期利用的分子标记。它是在对基因组DNA作RAPD分析后,将目标RAPD片段进行克隆并对其末端测序,然后根据RAPD片段两端序列设计特定引物,用此引物对基因组DNA片段再进行PCR扩增,这样就可以把与原来RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。2004年,邵鹏柱[7]等首次应用SCAR技术进行中药材种质资源的鉴别。他们首先制备人参和西洋参的RAPD指纹图谱,再从中找出一个多态性谱带进行测序,然后根据序列设计出特异性引物进行特异DNA片断的PCR扩增。最后选择一对较长的引物SCAR.F1和SCAR R1(长度分别为24bp和29bp)对所有人参属品种及其混淆品的基因组DNA进行PCR扩增,结果发现均能产生单一的条带。由此表明,SCAR技术可用于鉴别人参及西洋参的同属相关品种和混淆品。

SCAR标记技术不但特异性较高,而且具有快速、简便、低成本等特点,因此非常适合研究材料的大量分析,目前已广泛应用于许多经济作物和相关植物的分子标记辅助选择育种和种质资源的鉴别。

1.3 限制性片断长度多态性(RFLP技术)

RFLP是将不同生物个体基因组DNA分子,采用适当的限制性内切酶进行切割,再将酶切片断电泳,之后利用探针杂交并放射自显影,就得到了与探针高度同源的DNA带型。由于植物不同种、属间甚至品种间同源序列的限制性内切酶识别位点各不相同,因此通过比较RFLP片段的多态性,就可以揭示种、属间甚至个体间的差异及相关性[8]。日本名古屋市立大学水上元研究小组[9]对日本8个产地的野生柴胡进行RFLP分析,发现秋吉台、平尾台、香春、汤布院为代表的山口北九州地理品系的RFLP与其它品系明显不同。

尽管RFLP技术具有准确性高等优点,但操作步骤比较繁琐,需要进行核酸杂交和放射自显影,而后者会对环境和人体带来不良的影响。同时,RFLP分析技术还要求新鲜的材料,而一般药材都是经过干燥处理的。由此较大地限制了该技术在药用植物上的应用。

1.4 扩增片断长度多态性(AFLP技术)

AFLP技术是由荷兰科学家Zabeau和Vos等人创建的[10],1993年获得了欧洲专利局专利,1995年以论文的形式发表出来。AFLP是在RFLP和PCR的基础上发展起来的,利用了RFLP的可靠性和PCR的高效性。它用一套特别的引物在不需要知道DNA序列的情况下,对基因组DNA酶切片断进行选择性扩增,扩增产物要电泳分离检测,根据扩增片断的长度不同检测多态性。AFLP能够检测出亲缘关系很近的材料之间的差异,它是目前构建基因组的特定区段的高密度遗传连锁图谱最有效的方法。冉贵萍[11]等用AFLP技术对来自不同地区的3个品种共19份吴茱萸进行分子鉴别,结果发现扩增得到的93条带有57条具多态性,占61.3%,由此证明吴茱萸的遗传多样性比较丰富。

由于该技术具有准确、方便等特点,近年来该技术已广泛应用于遗传图谱的构建、中药基因定位、遗传多样性分析、分子标记辅助育种及生物系统分类等方面的研究。

1.5 简单重复序列间扩增(ISSR技术)

ISSR是于1994 年由加拿大蒙特利爾大学的Zietkiewics等提出来的。它是利用PCR扩增进行检测的一种DNA标记,所用引物根据简单序列重复设计而成,长度一般为14~20个碱基的寡核甘酸引物,用来检测两个SSR之间的一段短DNA序列的差异。具有重复性好、稳定性高、多态性丰富等优点,已广泛地应用于种质资源的鉴定、物种亲缘关系、植物分类进化和遗传多样性的研究。王清波[12]等用ISSR-PCR法对12份栀子种质资源的遗传多样性进行了研究,共扩增出126条带,其中92条具有多态性,占73.02%,最后聚类分析,建立了这些种质的亲缘关系图,结果显示栀子遗传多样性水平较低,种质间亲缘关系较近。

1.6 DNA测序法

DNA测序法是指通过测定目的基因片段的核苷酸序列并比较序列间的差异,确定各类群间有鉴定意义的特异性位点,从而达到鉴定的目的。此法要针对要解决药用植物的科属、种间还是种内居群间的差异问题,选择合适的基因片段进行序列测定和分析。章群[13]采用PCR直接测序法测定杜仲原植物的matK基因序列,然后用软件进行同源序列比较分析,结果表明此序列存在32个特异性位点,由此为杜仲原植物鉴定提供足够的特异性变异的位点,进而证明了matK基因序列测序分析可作为杜仲正品鉴定的有效手段。

近年来随着DNA测序法的发展,核糖体DNA ITS序列分析由于其基因片段短,扩增和测序容易的优势,在药用植物鉴别、道地性的研究、栽培与野生药用植物的遗传差异分析、较低分类阶元的系统发育和分类研究中发挥着重要作用[14]。蒋继宏[15]等研究苏皖产大戟属内6种药用植物ITS长度的变异,发现聚类所得的系统进化树与形态学的研究结果相符合,为探讨大戟属植物的系统演化关系和植物鉴定提供DNA分子依据。

2 分子标记技术在药用植物上的应用

2.1 药用植物的种质资源鉴定

药用植物种质资源的鉴定是药用植物研究的基础,它对于准确确定原植物、确保药效、合理保存利用现有的种质资源、寻找开发新的药用植物等具有重要的意义。

白芷是一种常用的中药,现在所用的商品药材多为栽培种,分为祁白芷和杭白芷,但它们与野生种的分类地位等尚未清楚。黄璐琦[16]等人对兴安白芷、祁白芷、杭白芷三者共29个个体的基因组DNA,用12个随机引物进行RAPD分析,共检测到40个位点,多态位点是26个,祁、杭白芷的多态位点百分率分别是45%、50%和57.5%,表现出低水平的遗传变异,最后通过遗传距离计算得出祁白芷、杭白芷应属一个类群。

当归是一种常用的中药,主产甘肃,但甘肃具有多个产地。为了研究当归的道地性形成的基因基础,高文远[17]等用RAPD法对不同来源地的18个当归样品进行分析。他们从25个随机引物扩增结果中筛选出10个谱带清晰有多态性的引物扩增结果,并计算了遗传距离,进行了聚类分析。根据电泳谱带得出此法可鉴定当归的真伪,还可为当归的药材道地性研究提供分子水平上的参考。根据聚类分析又得出地理分布的远近决定了遗传背景差异的大小,而生态条件尤其是小生境对遗传差异也有着不能忽视的影响。

绞股蓝具有降血脂、抗衰老、抗肿瘤等多种生理功效,但它和乌蔹莓得外部形态已经变成干药材后都很相似,这就带来安全用药的问题。李雄英[18]等运用RAPD技术对七叶绞股蓝、五叶绞股蓝和乌蔹莓这三种植物进行分析,实验中对RAPD反应体系、对BSA用量进行了优化,并最终从10条引物中筛选出了2条能较好的区别出绞股蓝和伪品乌蔹莓,从而从分子水平上为辨别绞股蓝的真伪提供了依据。

石斛是我国传统的名贵中药,具有很多重要的药用价值,但是石斛的种类繁多,历来难以辨别。沈颖[19]等运用了ISSR法对9种石斛进行种间鉴别,试图在DNA分子水平上的差异上解决鉴别的问题。他们首先进行基因组DNA的提取,然后进行ISSR-PCR反应及电泳。选用的引物是参考UBCBL的#9系列引物。除引物UBC-803、UBC-814、UBC-870外,其余均得到多态性扩增条带。UBC-807和UBC-864均可独立地区分9个不同种质的石斛。

2.2 药用植物的遗传多样性研究

药用植物无论是在种间还是种内,都存在着巨大的遗传多样性。药用植物遗传多样性研究对于研究种间亲缘关系的远近、生物的演化、自然种群保护等都具有重要的意义。

龙胆是多年生的草本植物,正品龙胆有4种,曹雅男[20]等用了RAPD和ISSR两种方法对4种正品龙胆43个个体的遗传多样性进行了分析。实验中,对RAPD扩增体系和ISSR扩增体系进行了优化,包括DNA模板浓度和纯度,反应体系中dNTPs、引物和酶的浓度、反应程序。分别从100个RAPD引物筛选出10个,从32个ISSR引物中筛选出4个引物用于遗传多样性分析,最后通过类聚分析树系图的比较,发现ISSR-PCR更能反映出龙胆的遗传多样性和个体间的遗传距离。

宁夏枸杞是我国重要的药用植物资源和药食同源的名贵中药材,具有增强免疫力、防衰老、抗肿瘤、抗氧化等多方面的药理作用。尚洁[21]等人用RAPD法对来自宁夏两个产地的七个品种进行分析,从79个随机引物中筛选出电泳谱带清晰多态性好的13个引物进行了扩增,共扩增123个位点,多态性位点68个,多态性达55.28%。由此表明选用的7个品种间具有较高的多态性。

白术是著名中药材“浙八味”中的一种,刘逸慧[22]等为了阐明国内栽培的白术种质资源遗传多样性和不同产地的遗传变异和分化,揭示不同产地的遗传关系,用ISSR法对7个不同产地的86个白术群体以及同一产地5个苍术样品的种质资源进行了遗传多样性分析。他们从61个引物中选出12个进行扩增,共扩增出63个条带,其中55条具有多态性,多态性比率高达87.30%。由此表明我国白术的遗传多样性较高,这有利于进一步选择与培育品质高的白术药材。

黄连也是一种常见的中药材,具有泻火、解毒、清热、燥湿和良好的抗菌作用。因此,它成为了国内外药学关注的热点,分析不同产地黄连的遗传多样性也具有重要的意义。陈大霞[23]等用ISSR法对产自四个主产地的32份材料进行鉴定,计算遗传相似系数,最后做聚类分析。从多态性上看,先从36个引物中选出较好的16个引物对供试材料进行ISSR-PCR扩增,得到106条带,51条呈现多态性,占48.1%,表明黄连的种质资源多态性不丰富。遗传相似系数的结果也显示各品种的亲缘关系比较近。遗传多样性需要有针对性地加以保护。

2.3 药用植物的亲缘关系分析

药用植物的亲缘关系、进化是遗传育种的重要内容,决定了种质在育种实践应用中的有效利用,是药用植物开发利用的依据。

柴胡是一种传统的常见中药,为多年生草本植物。邵天玉[24]等用RAPD技术对采自长白山不同地区的包括9个北柴胡和3个狭叶柴胡的12个柴胡样品进行了亲缘关系分析。他们以上述12个柴胡基因组DNA为模板,从75个随机引物中筛选出12个条带清晰、多态性高的引物。共扩增出122条带,106条为多态性条带,多态性达到86.9%。最后进行聚类分析,结果表明同地区的北柴胡亲缘关系近,北柴胡和狭叶柴胡的亲缘关系比较远。

曹秀明[25]等用RAPD和ISSR两种方法对东北产地的3个不同龙胆品种进行了亲缘关系分析。结果发现80个随机引物中有3个随机引物可把3种龙胆全部区分开。而7对SSR引物中有4对可区分不同龙胆。聚类分析结果表明,条叶龙胆、龙胆亲缘关系较近,三花龙胆和前二者亲缘关系较远。

天麻是公认的名贵并有较好经济效益的常用中药,天麻的产量与质量与种源品质密切相关,但是目前种源生产大部分是随意购买和自然采集后有性或无性繁殖获得的,长期重复的使用,使得种源质量退化。为了加强选育,王晓丽[26]等用RAPD和AFLP两种方法对六份天麻样品进行了分子检测,最后进行聚类分析。结果发现两种方法都有各自的多态性条带,都可从分子水平上区分出六份天麻种质的差异,但AFLP法多态性检测效果更好,最后确立乌天麻与其它亲缘关系较远,可作为育种的好材料。

3 展望

DNA分子标记技术与传统药用植物鉴定方法相比,可更直接地反映出品种或个体本身的遗传特性,且不受环境条件、生长发育阶段等因素的影响,结果更加可靠、稳定、特异性强。所以,它具有良好的应用前景,已被广泛地应用于药用植物研究的很多领域。尽管DNA分子标记的各种技术有自己的优势,但也有各自的不足。所以实验效果也会受到技术和参数选择不同的影响,因此选择合适的技术与参数非常重要。当然,进行具体的分子标记技术选择时,需要根据实际工作中具体的实验材料、实验目的以及实验室具备的实验条件等多种因素综合考虑和确定。

随着分子标记技术的运用和进一步发展,它们会更加的成熟,其中一些技术会得到改良,同时也会出现更多新的分子标记技术。我们相信,分子标记技术在药用植物种质资源研究上会有更加广阔的应用前景。

参考文献

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[26] 王晓丽,王晓玲,王晓多.天麻亲本材料的分子标记[J].贵州农业科学,2010,8(2):10-12.

作者:周洁 王忠华

吴茱萸化学成分分析论文 篇3:

吴茱萸水提组分多次给药对小鼠肝毒性的“量时毒”关系研究

[摘要] 目的:研究吴茱萸水提组分多次给药致小鼠肝毒性的时毒、量毒关系。方法: 取小鼠按不同时间点或不同剂量分组,分别给小鼠灌胃吴茱萸水提组分,观察小鼠死亡情况和毒性反应,分别于药后相应时间点检查血清肝功指标和肝脏组织谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性,计算肝、肾脏器指数,光学显微镜下观察肝组织形态变化。结果: 小鼠血清和肝组织ALT,AST在给药后1 d开始升高,3 d肝毒性明显,可持续到7 d。与正常组比较,药后7 d之内,吴茱萸水提组分在063~50 g·kg-1可造成小鼠明显的肝毒性损伤,表现ALT,AST,碱性磷酸酶(AKP),总胆红素(TBI)升高,白蛋白(ALB)降低,肝体比值增高,病理组织学检测出现不同程度的肝细胞水肿和脂肪变性、间质充血,呈现一定的量毒、时毒关系;上述变化随剂量的增加而逐渐加重,与正常对照组比较有明显差异。结论: 多次给小鼠灌服一定剂量的吴茱萸水提组分可造成明显的肝损伤,并呈现一定的肝毒性“量时毒”关系。

[关键词] 吴茱萸;水提组分;肝毒性;“量时毒”关系

[稿件编号] 20120428011

[基金项目] 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2009CB522802);山东省科技平台建设项目(2008GG2NS02021)

[通信作者] *孙蓉,研究员,博士生导师,研究方向为中药药理与毒理,Tel:(0531)82949843,Email: sunrong107@163com 吴茱萸是一味临床常用中药,系芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss)Benth、石虎E rutaecarpa(Juss)Benth varofficinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸E rutaecarpa(Juss)Benthvarbodinier(Dode)Huang的干燥近成熟果实。辛、苦、热,有小毒。归肝、脾、胃、肾经,能散寒止痛,降逆止呕,助阳止泻[1]。吴茱萸始载于《神农本草经》,列为中品,为温中止痛的必备药。近年来,国内外学者对吴茱萸的化学成分和药理作用等方面进行了深入研究。研究发现吴茱萸主要含有生物碱、挥发油、苦味素等化学成分[23],具有广泛的药理作用[4],其中生物碱是吴茱萸的主要有效成分[5],而吴茱萸次碱是生物碱中最主要的活性成分[68]。通过前期研究已证实吴茱萸水提组分具有一定的急性毒性[9],可造成一定的急性肝损伤,其对肝损伤均呈现有一定的“量时毒”关系。吴茱萸水提组分作为临床常用剂型,本实验结合临床肝脏不良反应报道进行了吴茱萸水提组分于给药1,3,7 d的小鼠肝毒性研究与评价,明确其多次给药导致的肝毒性“量时毒”关系的异同,为临床安全用药提供实验依据。

1 材料

1.1 药品 吴茱萸药材购自安徽亳州市鲁康药材站(批号20090617),经山东省中医药研究院林惠彬研究员鉴定为芸香科植物吴茱萸E. rutaecarpa的干燥近成熟果实,按2005年《中国药典》吴茱萸项下检查,符合各项规定。吴茱萸水提组分(批号20090709),由本试验室提取制备,生药量20 g·mL-1 ,现用现配。

1.2 动物 昆明种小鼠,雌雄各半,体重18~22 g,适龄、健康,共180只,购自山东大学实验动物中心,动物合格证号SCXK(鲁)20090001。

1.3 仪器与试剂 PL303精密电子天平(瑞士梅特勒托利多仪器有限公司),可调式移液器(上海赛默飞世尔仪器有限公司),560全自动生化分析仪(德国贝尔公司),DDL5型低速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),DZKMS6电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂),UV2102型紫外分光光度仪(中美合资尤尼柯有限公司)。ALT,AST,AKP,TBI,ALB测定试剂盒购自南京建成股份有限公司。

2 方法

2.1 动物分组 取小鼠120只,雌雄各半,按体重随机分为4组,每组30只,即正常对照组、吴茱萸水提组分高、中、低剂量组。

2.2 剂量设计 根据吴茱萸水提组分的经口急性毒性试验结果和药效伴随毒剂量设置为依据,设定吴茱萸水提组分高、中、低剂量组分别为50,2.5,063 g·kg-1,均按25 mL·kg-1灌胃1次,正常组灌服蒸馏水,药物组分别灌服一定剂量的药物。

2.3 小鼠肝毒性“量时毒”关系研究 药物组小鼠灌胃给予不同剂量的吴茱萸水提组分,给药体积均为25 mL·kg-1;正常对照组小鼠灌胃给予等体积蒸馏水。连续给各组小鼠灌胃1,3,7 d,每天给药1次,给药期间观察小鼠体重、饮食饮水、毛色等一般状况。分别在给药后1,3,7 d,于相应时间点称小鼠体重,自小鼠眼眶静脉丛取血3 000 r·min-1离心10 min,取血清,按相关照试剂盒说明书的操作说明,用自动生化分析仪测定血清ALT,AST,AKP,ALB,TBI水平。取血后剖取小鼠肝、肾等脏器称重并计算脏器指数。另取一部分肝脏迅速冻存备用。

另取一部分肝组织,常规HE染色,光学显微镜下观察其组织形态学变化。对肝组织形态进行病理分级、积分:肝组织结构正常,无明显变性、坏死及炎症细胞浸润,0分;肝小叶结构尚正常,可见明显的混浊肿胀、气球样变或脂肪变性,散在点状坏死(+),1分;肝小叶结构不清,可见明显的灶状坏死,伴有炎症细胞浸润(),2分;肝小叶结构不清、可见明显的片状坏死,伴有炎症细胞浸润(),3分;坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央,层次较多,伴有炎症细胞浸润(),4分。

2.4 统计学方法 数据用±s表示,采用SPSS 11.5统计软件对各组参数进行单因素方差分析。进行组间比较,P<0.05为数据统计有显著性差异。

3 结果

3.1对小鼠体重的影响 吴茱萸水提组分各剂量组随着给药时间的增长,体重增长均有减慢的趋势,其趋势呈现一定的“时毒”关系;同一给药时间点上,同一组分高、中、低剂量组之间呈现一定的“量毒”关系。水提组分在给药后5 d高剂量组体重与水对照组比较有显著性差异,中、低剂量组无显著性差异;给药后7 d水提组分高、中、低剂量组呈现不同程度的显著性差异,见表1。

表1 吴茱萸水提组分多次给药对小鼠体重的影响(±s,n=10)

Table 1 The influence of body weight caused by multiple dose water extraction components of Evodia Fructus to mice(±s,n=10)

注:与正常组比较1)P<0.05, 2)P<0.01, 3)P<0.001(表2~7同)。

3.2 对小鼠肝功指标的影响 见表2~4,正常组小鼠各血肝功指标水平均在正常范围内。吴茱萸水提组分各剂量组在给药后1 d血清ALT,AST开始有不同程度的升高;随着给药时间的增长,各剂量组对小鼠肝毒性指标损伤呈现不同程度的“累加效应”,给药后7 d,吴茱萸水提组分高、中、低剂量组之间与正常组比较,呈现不同程度的显著性差异。见表5,正常组小鼠肝脏ALT, AST指标水平均在正常范围内。吴茱萸水提组分各剂量组在药后1 d肝脏ALT,AST水平均开始有不同程度的升高,其中水提组分高剂量组ALT,AST指标水平与正常组比较均呈显著性差异;随着给药时间的增长,不同组分各剂量组对小鼠肝毒性肝内ALT,AST呈现不同程度的“累加效应”,药后7 d,水提组分高、中、低剂量组之间与正常组比较,呈现不同程度的显著性差异。提示随着给药时间的增长,高、中、低剂量各指标均有所加重,且各剂量呈现不同程度的加重,呈现一定的“量时毒”关系。

3.3 对脏器指数的影响 吴茱萸水提组分各剂量组在药后1 d肝脏指数均开始有不同程度的升高,各剂量组肝脏指数与正常组比较呈不同程度的显著性差异;随着给药时间的增长,各剂量组对小鼠肝毒性、肝脏指数呈现不同程度的“累加效应”,药后7 d,各药物组肝脏指数达最大,水提组分高、中剂量组肾脏指数均增大,与正常组比较均有显著性差异。提示吴茱萸水提组分对小鼠毒性的累加效应并不是单一效应的毒性累加,而是多效应的累加,见表6。表2 吴茱萸水提组分给药1 d后对小鼠血清肝功指标的影响(±s,n=10)

Table 2 The influence of hepatic function indexes in serum after 1 day′s water extraction components of Evodia Fructus administration to mice(±s,n=10)

3.4 对肝组织形态的影响 吴茱萸水提组分对小鼠肝毒性肝组织Riddit 分析病理积分表,见表7,光镜下观察,正常组肝小叶结构清晰完好,肝细胞未见明显变性、坏死,肝窦未见明显瘀血扩张,肝组织Riddit分析病理积分在正常范围内;吴茱萸水提组分给药1 d后,肝组织即可出现不同程度的病变,水提组分高剂量组Riddit分析病理积分与正常组比较呈显著性差异。随着给药时间增长,各剂量组对小鼠肝毒性肝脏病理损伤呈现不同程度的“累加效应”,给药后7 d,肝脏病理组损伤最严重,各剂量组肝组织Riddit分析病理积分与正常组比较,呈现不同程度的显著性差异。提示随着给药时间的增长,高、中、低剂量肝脏组织损伤呈现不同程度的加重,呈现一定的剂量依赖关系。给药后1,3,7 d典型病理照片,见图1。

4 讨论

古代文献对吴茱萸的毒性早有记载。《本草纲目》记载:吴茱萸“多食伤神,令人起伏气,咽喉不通”,“辛热,走气动火,昏目发疮”, “不宜多用恐损元气”,“有小毒,动脾火,病目者忌之”等[10]。可见古人对吴茱萸的毒性已经有一个深刻的认识。临床上因服用了未制透的吴茱萸或直接服用了生品吴茱萸,或因超剂量服用而产生中毒的报道时有发生,作者前期试验发现小鼠单次灌服一定剂量吴茱萸水提组分可造成急性肝损伤,并呈现一定的时毒、量毒关系。在此基础上考虑到吴茱萸为临床常用中药,水煎剂为其临床常用剂型,且具有成分复杂、反复用药的特点,故进行了吴茱萸水提组分多次给药对小鼠肝毒性的“量时毒”关系研究。

结果显示小鼠在药后1~3 d肝毒性表现已非常明显,3~7 d可以逐渐增加。且随着时间的延长既有单一毒性效应的程度增加,也有非单一效应、非线性的毒性增加。对吴茱萸水提组分多次给药致小鼠肝毒性“量毒”关系的研究显示:吴茱萸水提组分在063~50 g·kg-1小鼠肝毒性损伤呈现明显的剂量依赖关系,表现在血肝功指标,肝脏指数、病理变化的依赖剂量的增高或降低,基本与单次肝毒性“量时毒”关系研究相吻合,但是多次给药对肝毒性损伤的累加效应并不是单一效应的毒性累加,而是多效应、非线性累加。吴茱萸水提组分在50 g·kg-1剂量下给药1 d即可开始出现肝损伤,在063 g·kg-1剂量下连续给药7 d出现明显肝损伤,因此临床应用时应该引起重视。

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[责任编辑 陈玲]

作者:黄伟 李晓骄阳 孙蓉